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蛋白质在生物系统中起着至关重要的作用，参与生命所必需的各种代谢过程。由于它们的重要性，它们被广泛应用于制药等行业，在这些行业中，它们有助于药物开发（例如抗生素和生物制药），以及食品生产，在这些行业中，它们作为营养补充剂的关键成分。鉴于它们在健康相关应用中的预期用途，在蛋白质提取过程中实现高纯度是至关重要的、�/p>

在各种可用的纯化方法中，色谱法因其在分离蛋白质方面的有效性而经常被采用。通常使用的技术包括离子交换，疏水相互作用，亲和，反相和凝胶过滤色谱、�span style="color: rgb(86, 172, 221); box-sizing: border-box;">反相色谱法已成为多肽和小蛋白质分离中最重要的工具。由于它的杰出分离能力，即使多肽只相差一个氨基酸残基，也常常可以被分离、�/strong>此外，反相色谱法使用水混合物作为流动相，因此该方法与含水样品兼容。反相色谱法广泛用于调查研究中的杂质检测或治疗药物的大规模纯化中去除不需要的化合物。由于反相色谱法使用极性有机溶剂作为流动相，因此该方法只能用于能够承受严格条件的化合物、�span style="color: rgb(86, 172, 221); box-sizing: border-box;">这种类型的色谱通常适用于肽和小的、稳定的蛋白质，这些蛋白质在纯化后会自发地重新折叠、�/p>

反相色谱法可作为Flash法或高效液相色谱法进行。这两种技术经常被使用，但目的不同９�span style="color: rgb(86, 172, 221); box-sizing: border-box;">Flash色谱法主要用作纯化前步骤，以足够的分辨率纯化大量样品，而高效液相色谱法的目标是在较低上载量的条件下获得最高的分辨率（纯度（�/strong>。因此这两种技术的不同之处在于固定相所用的材料（不同的粒度）、色谱柱的尺寸（内径和长度）和流动相的流速、�/p>

�?：Flash色谱与高效液相色谱的差异

蛋白质是复杂的分子，采用特定的三维结构，由氨基酸残基和周围溶剂之间的相互作用决定。这种结构折叠定义了它们的水动力半径，它描述了它们在水溶液中的有效尺寸、�span style="color: rgb(86, 172, 221); box-sizing: border-box;">在色谱法中，蛋白质穿透固定相孔隙的能力直接影响分离效率、�/strong>色谱介质中较大的孔径允许更好地进入固定相，提高蛋白质分离的分辨率。固定相的颗粒大小也会影响蛋白质与表面的相互作用。较小的颗粒提供更多的相互作用位点，导致更明显的分离，而较大的颗粒限制了接触面积，降低了分辨率、�strong style="box-sizing: border-box;">优化孔隙和颗粒大小是实现高效蛋白质纯化的必要条件、�/span>

蛋白质在色谱分离过程中的行为在很大程度上受其电荷的影响，这取决于溶剂的pH值。为了保持蛋白质的稳定性，通常在缓冲溶液中进行纯化，以保持其天然结构、�/strong>在某些情况下，改变pH值是一种有效的策略，可以改变蛋白质的电荷，提高分离效率、�/p>

实验设备

试剂和材斘�/strong>

实验步骤

本研究的色谱图是在以下实验条件下生成的：

�?. 梯度1

�?. 梯度2

�?. 梯度3

先前的实验表明，使用PrepPure C18WP �?00 Å）柱�?0 μm作为固定相，可以实现最佳的蛋白分离。图1是样品的色谱图，使用PrepPure C18WP �?00 Å）， 10 μm，在类似参考文献的梯度下（梯度1�?0%-90%，超�?0分钟）。与参考文献不同，根据洗脱顺序，只观察到以下峰：卵泡样蛋白、卵泡红蛋白、溶菌酶、卵泡转铁蛋白和卵泡白蛋白。这些差异可归因于用于样品制备的鸡蛋的质量和来源的差异、�/p>

为了完善分离条件，我们进行了多次实验，以优化目标蛋白的分辨率。图2显示了PrepPure C18WP �?00 Å）， 10 μm，在梯度2�?0%�?0%�?0%下获得的色谱图，这有利于目标蛋白的分离、�/p>

接下来，�?nbsp;�?的实验条件为参考，研究了孔径和粒径的影响、�/p>

�?为与�?相同条件下的色谱图，使用C18非WP �?00 Å� （PrepPure C18, 10 μm）研究孔径的影响。虽然紫外信号表明与C18WP相比，前两个峰的分辨率提高了，但较低的吸光度和ELSD信号表明没有发生有效的分离。C18WP的大孔径�?00 Å）使蛋白质能够穿透颗粒并有效地与固定相相互作用。相比之下，PrepPure C18 �?00 Å）， 10 μm无法实现分离，因为蛋白质只能与颗粒的外表面相互作用。这种有限的相互作用减少了吸附和解吸之间的平衡步骤的数量，从而影响了分离效率、�/p>

�?�?显示了在�?nbsp;�?和图3相同的条件下（梯�?），使用Flash色谱柱：FlashPure Select C18 �?00 Å）， 30 μm和EcoFlex C18 �?00 Å）， 50 μm的色谱图。当颗粒尺寸大于10 μm时，分离效果不明显。表面相互作用的减少进一步限制了吸附和解吸之间的平衡步骤，使该梯度不足以有效分离。因此所有蛋白质�?0%的梯度同时洗脱。此外，随着颗粒大小的增加，更多的蛋白质�?0%时共洗脱，减少了之前观察到的30%的洗脱、�/p>

结论

参考文�?/strong>

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